以苹果矮化砧木M9和乔化砧木MM106为材料,克隆到一个3 753 bp的核苷酸序列,其编码1 250个氨基酸,含有两个ABC_membrance结构域,两个ABC_tran结构域,与梨、油菜和拟南芥的ABCB19基因高度同源,命名为MdABCB19。该序列在M9和MM106中存在一个非同义SNP,编码氨基酸由A突变为S,导致M9 α螺旋少了一段。表达量分析表明,MdABCB19在砧木M9和MM106、长富2号/M9和长富2号/MM106均差异表达。启动子序列分析发现M9的MdABCB19启动子在起始密码子上游170 bp处有6个碱基(CTCTGT)缺失,导致缺失一个5'UTR Py-rich stretch motif。MM106的MdABCB19启动子活性高于M9,并且受光照调控。推测M9的MdABCB19启动子5'UTR Py-rich stretch motif缺失可能与其MdABCB19低表达有关;而氨基酸突变导致蛋白质三级结构α螺旋结构改变是否影响生长素运输,有待进一步研究。上述研究表明苹果MdABCB19可能通过调控生长素转运参与砧木苗矮化性状的调控。
为分析不同李品种果实中多酚含量及其抗氧化能力,以14个李品种为试材,测定果皮和果肉中的多酚含量,采用超氧自由基( )清除法、羟自由基(OH·)清除法、DPPH法、FRAP法和TBARS法测定抗氧化能力,比较多酚含量、抗氧化能力的差异,分析多酚含量与抗氧化能力的相关性,比较抗氧化能力测定方法间的相关性。结果表明:(1)李果实中富含多酚并且品种间存在差异,不同品种果皮中含量为1.40 ~ 3.37 mg · g-1 FW,果肉中含量为0.50 ~ 0.97 mg · g-1 FW,果皮中含量远大于果肉中含量;果皮中多酚含量较高的李品种为皇后李、猪肝李,其次为黑宝石李、红玫瑰李;果肉中多酚含量最高的为秋姬李,其次为威克逊李。(2)李果皮、果肉多酚提取物均具有较强的抗氧化能力,果皮提取物综合抗氧化能力较强的为皇后李、黑宝石李和猪肝李,果肉的为红美丽李、红玫瑰李和秋姬李。(3)果皮中多酚含量与清除 、OH·能力及DPPH、FRAP、TBARS均呈极显著正相关,果肉中多酚含量与抗氧化能力呈显著正相关。(4)对5种方法的相关性分析表明,各方法从不同的角度评价李果多酚抗氧化能力,方法间均具有很好的相关性,DPPH法与FRAP法综合评价最佳,可作为主要选择。
中国南方许多地区因土壤pH值偏高或偏低,严重影响柑橘的产量和质量。筛选适合不同pH环境的优良砧木对改善柑橘的生产条件具有重要意义。以扁平橘、朱橘、汕头酸橘、枸头橙、卡里佐枳橙、尼8047、道县野橘和聂都野橘等8种柑橘砧木实生苗为试验材料,在酸性(pH 3.5)和碱性(pH 9.0)营养液栽培条件下调查叶片症状并测定叶片中与抗逆性紧密相关的丙二醛、可溶性蛋白、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性等指标,通过聚类和隶属函数分析,综合评价不同砧木对酸、碱的耐性。分析结果表明:叶片表型症状的观察结果与生理生化指标分析结果基本一致;在酸性(pH 3.5)条件下,汕头酸橘、尼8047和扁平橘表现出较强的耐性,聂都野橘和道县野橘较为敏感;在碱性(pH 9.0)条件下,朱橘、枸头橙和扁平橘表现出较强耐性,而聂都野橘和道县野橘的耐性较弱。扁平橘在酸、碱环境下均表现出较强的适应性,是一个具有一定应用潜力的优良砧木。
以江津甜橙的低酸小果变异品种‘长叶橙’(Citrus sinensis L. Osbeck‘Changyecheng’)和高酸大果芽变品种‘大果锦橙’(C. sinensis L. Osbeck‘Daguo Jincheng’)为材料,对其AREB(ABA responsive element binding)/ABFs(ABRE binding factors)转录因子基因,即CsAREB1和CsAREB2进行了生物信息学及时空表达分析;采用酶联免疫法(ELISA)测定了不同发育时期果实内源激素(ABA、IAA、GA和ZR)含量。结果表明:CsAREB1的开放阅读框(ORF)长度为1 338 bp,编码445个氨基酸;CsAREB2的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸。CsAREB1和CsAREB2在叶、花、果中的表达存在组织特异性。在果实发育过程中,CsAREB1的表达量在‘长叶橙’中呈上升趋势,在‘大果锦橙’中呈先降后升趋势;CsAREB2的表达量在2个品种中总体均呈上升趋势。在果实细胞分裂期,‘长叶橙’果实CsAREB1、CsAREB2的表达量高于‘大果锦橙’,而在果实膨大期的果皮组织中‘长叶橙’低于‘大果锦橙’,在果肉组织中没有显著差异。两品种CsAREB1和CsAREB2的表达均受外源ABA的诱导。在细胞分裂期和膨大期的果皮组织中‘大果锦橙’中IAA、GA、ZR含量,以及IAA、GA、ZR与ABA的比值均高于‘长叶橙’,而在膨大期果肉组织中这一比值低于‘长叶橙’。随着果实的发育,CsAREB1和CsAREB2的表达量变化与果实内源ABA的含量变化趋势基本一致,而与其他内源激素的含量变化无明显相关关系。研究结果表明:CsAREB1和CsAREB2的转录水平受ABA的调控,通过参与柑橘果实ABA生成,影响柑橘果实体积发育过程。
以纽荷尔脐橙和四季橘为试验材料,基于溃疡病菌诱导的柑橘转录组数据库,利用PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因CsWRKY22、CsWRKY50、CsWRKY72-1和CsWRKY72-2的cDNA全长序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长分别为1 123、1 312、1 809和2 208 bp,开放阅读框长度分别为921、480、1 809和1 767 bp,各编码306、159、602和588个氨基酸。氨基酸序列和结构分析显示,这4个基因属于第Ⅱ类WRKY蛋白。进化树分析显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与可可、葡萄等WRKY蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位显示,所克隆的4个WRKY基因定位于细胞核,与亚细胞定位预测相符。对纽荷尔脐橙和四季橘中4个基因受溃疡病菌诱导的表达分析表明,CsWRKY22参与寄主的感病反应,而CsWRKY50参与抗溃疡病的免疫应答反应。柑橘溃疡病菌能抑制CsWRKY72-1和CsWRKY72-2介导的寄主基础免疫。水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理表明,4个CsWRKY基因均不参与SA和MeJA介导的寄主抗病和抗逆反应。
为阐明芥菜开花抑制因子AGL18与开花整合子SOC1间的互作调控机制,在芥菜‘QJ’的开花期克隆了AGL18-1,幼苗期克隆了AGL18-2和AGL18-3,它们分别编码257、257和258个氨基酸,为AGL18家族的3个成员。序列比对表明,芥菜AGL18家族成员与十字花科芜菁和油菜同源性均高达90%。酵母双杂交和BiFC试验表明:芥菜AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3蛋白与SOC1不会发生蛋白相互作用。酵母单杂交和Dual-Glo® Luciferase试验表明:AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3中仅有花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子间存在互作。为进一步筛选AGL18-1/SOC1的互作区域,分别截取了AGL18-1蛋白的M域和IKC域,发现仅M域与SOC1启动子存在相互作用,说明M域是介导花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子互作的关键区域。这为深入研究AGL18与SOC1互作的分子机制及其对开花时间的调控奠定了基础。
为筛选茄子(Solanum melongena L.)高温胁迫下稳定表达的内参基因,以不同茄子品系(种)为研究对象,PCR技术对来自茄子高温胁迫转录组数据库8个候选内参基因(SmEF1a、SmEF2、Sm40sRPS29、Sm60sRPL24、SmTRX、SmCK I、SmDAHPS I、SmUCP)和SmActin在不同试验情况下进行表达检测,并结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ReFinder软件综合评价9个内参基因的表达稳定性。结果表明,在茄子热敏品系05-1和耐热品系05-4经高温处理不同时间的样品和不同组织样品以及10个耐热性不同的茄子品系(种)中,9个内参基因的表达丰度及稳定性存在差异;茄子热敏品系05-1和耐热品系05-4高温胁迫处理不同时间样品中表达稳定性最好的是SmEF1a和SmUCP;其不同组织中表达水平最稳定的是SmEF1a和SmTRX;高温胁迫下不同茄子品系(种)中以SmTRX和SmEF2的表达稳定性最好。综合来看,SmEF1a和SmTRX在所有茄子试验样品中的表达稳定性最好,而SmActin和SmCK I的表达稳定性较差。利用实时荧光定量
为明确重庆地区辣椒上番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)的发生情况及其外壳蛋白基因(cp)序列变异特征,采用斑点免疫杂交法(Dot-ELISA)和反转录PCR(RT-PCR)技术对采自重庆的298份辣椒病毒病样品进行了检测和分子鉴定。Dot-ELISA检测结果表明,有40份辣椒样品检测到TSWV,检出率为13.42%。通过电子显微镜在TSWV检测呈阳性的样品中观察到具包膜的球状病毒粒体。设计扩增TSWV cp的引物,选取6个TSWV阳性样品进行RT-PCR扩增,均扩增到大小约750 bp的目的片段。序列分析表明,重庆辣椒分离物TSWV-CQ(KX611497)与已报道的22个TSWV分离物cp基因的核苷酸相似性为96.1% ~ 99.4%,与已报道的TSWV中国分离物亲缘关系较近,表现出明显的地理相关性。
选用对5–氟乳清酸(5-FOA)敏感的金针菇单核菌株‘DG1-1’作为供试菌株,对其原生质体采用功率为10 W的紫外光进行垂直距离15 cm照射12 s的诱变处理,利用含有5-FOA和尿嘧啶的筛选培养基筛选获得了3株稳定的尿嘧啶营养缺陷型突变菌株‘NG1-65’、‘NG1-92’和‘NG1-95’。通过对尿嘧啶合成代谢路径中的pyrF和pyrG基因的分子检测发现,‘NG1-65’菌株的pyrF基因第39位和40位碱基之间插入T,‘NG1-92’菌株的pyrG基因第236位碱基T突变为C,‘NG1-95’菌株的pyrF基因第104位碱基C突变为T,这些插入突变和点突变可能导致基因编码的蛋白功能失去活性,产生尿嘧啶营养缺陷型。金针菇尿嘧啶缺陷型菌株可以为金针菇遗传转化体系的构建提供材料。
为了揭示花分生组织决定基因AP1(APETALA1)的分子机制以及物种间的进化关系,从GenBank数据库挑选8个不同植物AP1基因编码序列,利用R软件分别计算GC含量、有效密码子数(Effective number of codons,ENC)、同义密码子相对使用度(Relative synonymous codon usage,RSCU)、相对密码子使用偏好性(Relative codon usage bias,RCBS)等参数,分析比较不同植物AP1基因密码子使用模式中密码子偏好性和碱基组成动力学。结果表明,不同植物AP1基因密码子使用受到GC偏好性(GC bias)影响,特别是GC3s;大多数最优密码子偏好使用以A/U结尾,其中不同植物AP1基因中ACA、AUA和CAG均表现为较高的RSCU值,为最优势密码子;芍药(Paeonia lactiflora)和牡丹(Paeonia suffruticosa)AP1基因的密码子使用特点相似,碧桃(Prunus persica)和苹果(Malus × domestica)相似;较低的最优密码子频率Fop值和较高的ENC值暗示了不同植物AP1基因在密码子使用中具有一个较弱的偏好性。
以香石竹(Dianthus caryophyllus)‘马斯特’为试验材料,在分析香石竹和石竹转录组数据的基础上克隆得到10个水孔蛋白(AQP)基因,7个属于PIP亚家族,3个属于TIP亚家族;其中DcaAQP1、DcaAQP2、DcaAQP3、DcaAQP4、DcaAQP6、DcaAQP8和DcaAQP10在萼片中优势表达,DcaAQP5在茎和花瓣中优势表达,DcaAQP7在叶中优势表达,DcaAQP9在各个组织中表达均比较低;在切花开放萎蔫过程中,DcaAQP1、DcaAQP3和DcaAQP6的表达量从花蕾期开始升高,半开期达到最高,DcaAQP4、DcaAQP7、DcaAQP9和DcaAQP10在盛开期表达量达到最高;DcaAQP2在花蕾期表达量最高,DcaAQP5在开始萎蔫期表达量达到最高,表明多个AQP基因协同作用来维持切花开放萎蔫过程中花瓣细胞水分吸收和营养物质转运。
以金桂及其芽变花为试验材料,利用英国皇家园艺学会比色卡(Royal Horticultural Society Color Chart,R.H.S.C.C.)和色差仪测量两种花的颜色表型,通过显色法和紫外—分光光度计初步确定了两种花的主要色素类型,并且利用高效液相色谱—光电二极管阵列(HPLC–DAD)测定花瓣中类胡萝卜素和总黄酮含量,利用高效液相色谱—大气压化学电离源—质谱联用技术(HPLC–APCI–MS)和标准品鉴定主要类胡萝卜素成分。结果发现,芽变枝条上的花色由母本的黄色(R.H.S.C.C. 12B ~ 13A)变为橙红色,且花瓣边缘和内部颜色不同(内侧R.H.S.C.C. 23B,花瓣外缘R.H.S.C.C. N25A);两种花瓣中均含黄酮类化合物,不含花青素苷,且两者的类胡萝卜素含量存在一定差异;从两种花瓣中分离鉴定出主要的类胡萝卜素成分为α–胡萝卜素和β–胡萝卜素,这两种组分和类胡萝卜素总量在芽变花瓣中极显著高于母本,而两种花瓣的总黄酮含量无显著性差异。因此,最终可以确定引起芽变花色变化的主要色素成分为类胡萝卜素。
从茶树‘黄旦’和‘金观音’抑制差减文库中筛选出1条烯醇酶(Enolase,ENO)cDNA片段序列,以‘铁观音’芽叶为材料克隆并验证该序列的全长编码cDNA序列。该序列全长1 753 bp,含有1个1 332 bp完整的开放阅读框,命名为CsENO,登录号KX962311。序列基因编码444个氨基酸,氨基酸序列分析发现,该cDNA与其他植物ENO高度保守,包含ENO特异结构域,与苹果(Malus × domestica)、白梨(Pyrus bretschneideri)的亲缘关系较近,相似性达84%。生物信息学预测结果显示,CsENO属于稳定的亲水蛋白,不存在跨膜结构,无信号肽,可能定位在过氧化体、溶酶体或核糖体等细胞质中,且具有多个磷酸化位点;二级结构主要由α–螺旋构成。实时荧光定量PCR结果表明,CsENO在低温、ABA、高盐、干旱逆境胁迫处理下均有表达,且表达受到不同程度的诱导。
为探索草莓光形态建成抑制子FaCOP1的功能及其表达特异性,采用同源克隆法获得‘丰香’草莓FaCOP1的完整开放阅读框序列,对该序列及其编码的氨基酸序列进行相关生物信息学分析,同时采用qRT-PCR分析该基因的时空表达以及在不同光质处理下的表达模式。结果表明,FaCOP1开放阅读框全长1 989 bp,GenBank登录号为KX583676,编码662个氨基酸,蛋白质分子量为74.7187 kD,理论等电点为6.54,具有环形锌指域,卷曲螺旋域和WD40重复序列等3个保守结构域。序列比对以及系统进化树分析发现,COP1进化过程中具有高度保守性以及物种间的差异性。qRT-PCR结果表明,FaCOP1在草莓的根、茎、叶、花及成熟果实中均有表达,花中的表达量最高,其次是叶和根,而茎和成熟果实中最少。随着草莓果实的发育(从小绿期到全红期)FaCOP1的转录水平总体呈现递减的规律,与果实花青素积累模式相反。草莓叶片和果实的FaCOP1表达均能够被白、红、蓝及红蓝光(1︰1)诱导。FaCOP1在转录水平上没有阻遏FaHY5的表达,其关系需在蛋白质水平上进一步验证。
采用顶空固相微萃取和气相色谱—质谱联用(SPME–GC–MS)技术检测了多花刺槐(Robinia neo-mexicana var. luxurians),粘枝刺槐(R. viscosa),‘紫艳青山’、‘多彩青山’、L2F和L68F刺槐(R. pseudoacacia)鲜花芳香成分。结果表明:(1)6种刺槐鲜花共检测出53种芳香成分,主要有萜烯类、醇类、酯类、酮类、醛类、芳香烃类、烷烃类;在6种刺槐鲜花所释放的芳香成分中均含有萜烯类、醇类、酯类,且相对含量均为:萜烯类 > 醇类 > 酯类,萜烯类是最主要的芳香成分。(2)开红花的多花刺槐和粘枝刺槐鲜花芳香成分相对含量最多的萜烯类、醇类分别是 (E)–4,8–二甲基–1,3,7–壬三烯、1–辛烯–3–醇,其余4种开白花的刺槐鲜花芳香成分相对含量最多的萜烯类、醇类分别是β–罗勒烯、芳樟醇。(3)根据芳香成分相对含量及种类的多少,将多花刺槐和‘多彩青山’刺槐的鲜花定为淡香型,粘枝刺槐,‘紫艳青山’、L2F和L68F刺槐定为浓香型。
建立了桃果实、叶片和土壤中草甘膦(PMG)及其代谢物氨甲基膦酸(AMPA)的高效液相色谱—串联质谱(HPLC-MS/MS)的检测方法。样品经碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷共同提取,以9–芴基甲基三氯甲烷为衍生剂室温下衍生3 h,多反应监测(MRM)模式检测。草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸在1 ~ 2 000 μg · L-1的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999;在0.01 ~ 1.0 mg · kg-1添加水平下平均回收率为76.7% ~ 93.0%,相对标准偏差(RSD)为2.2% ~ 8.7%;方法定量限(LOQ)均为0.01 mg · kg-1;适用于桃果实和叶片及土壤中草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸残留的快速检测。
DNA甲基化是调控基因表达的一个重要方式,是表观遗传学研究的重点内容。目前测定某一基因DNA甲基化程度主要是先通过重亚硫酸盐转化,PCR扩增,再通过克隆、测序,检测PCR产物中胞嘧啶(C)转化为胸腺嘧啶(T)的比例。基于这种原理,建立了酶联免疫反应检测PCR产物中胞嘧啶转化为胸腺嘧啶的比例,计算出DNA甲基化率的新方法,并成功利用该方法测定了芜青(Brassica rapa L.ssp. rapiferu Metzg)纯合子和杂合子植株中隐性SP11基因启动子区域DNA甲基化程度。与原有克隆测序方法相比,该方法更加经济、省时。
在界定分子育种概念的基础上,综述了近30年番茄主要农艺性状相关基因克隆及其调控的研究进展,简要分析了番茄分子育种研究现状,初步探讨了未来中国番茄分子育种的发展策略。
‘福秀’是从‘瑞光19号’×(‘北京晚蜜’+‘冠华雪桃’等)杂交后代中选育出的极晚熟油桃优良新品种。果实圆形,平均单果质量189.7 g,最大293.9 g。果皮底色绿白色,果面深红色。果肉白色,硬溶质,可溶性固形物18.9% ~ 25.1%,可滴定酸0.1%,果肉硬度12.5 kg · cm-2,可食率96.2%。在山东烟台地区9月下旬—10月上旬成熟,果实发育期160 d;早果,丰产,4年生树产量38.1 t · hm-2。
‘吉农番茄5号’为保护地专用樱桃番茄杂交一代新品种。无限生长型,第一花序着生在第7 ~ 8节位,花序间隔2 ~ 3节,每穗结果15 ~ 20个,单果质量13 ~ 17 g。果实红色,椭圆形,果形指数1.41,坐果率95%,果实中维生素C含量0.1267 mg · g-1,可溶性固形物7.85%,有机酸0.55%。极早熟,高抗病毒病和青枯病,中抗灰霉病和叶霉病,适合保护地栽培。
‘西甜4号’为早熟优质厚皮甜瓜杂交一代新品种。全生育期85 d,果实发育期27 d。果实正圆,单果质量0.6 ~ 1.5 kg,白皮,橘肉,肉厚,肉质酥脆,清香爽口,中心可溶性固形物含量17%以上,糖分梯度小。果实耐贮运,抗病性强,产量37 500 ~ 45 000 kg · hm-2。
‘红袍’是由母本‘罗丽娜’和父本‘爱国者’经杂交选育而成的标准型切花非洲菊新品种。花序正面紫红色,花心黑色,半重瓣,花序直径11 ~ 13 cm,花梗长52 ~ 69 cm,花梗硬朗。温室栽培单株年产切花22 ~ 26枝,耐储运,瓶插期12 ~ 13 d。
兜兰新品种‘绿翡翠’(Paphiopedilum‘SCBG Lvfeicui’)是以报春兜兰(Paph. primulinum)优良株系为母本,菲律宾兜兰(Paph. philippinense)优良株系为父本,通过人工授粉杂交后选育出的新品种。生长势旺盛;叶面绿色,叶背浅绿色;花葶近直立,平均长16.5 cm,灰色,有白毛,平均花数2.5朵。花朵平均横径12.2 cm,纵径7.5 cm;中萼片绿色,具有灰褐色脉纹,花瓣丝带状,浅绿色,有紫褐色斑纹,唇瓣黄绿色;退化雄蕊心形,绿色。易开花,开花期4—6月,单朵花寿命30 ~ 35 d。